酵母文库构建
产品描述
服务简介
酵母文库构建是一项将外源DNA片段(如cDNA、基因组DNA或人工设计的序列)高效插入酵母表达载体,并转化进酵母细胞群体,形成大规模克隆集合的核心技术。该文库可用于高通量筛选目标基因或研究基因功能。七辰生物可提供以下三种建库方法:In-Gate技术、SMART技术、Gateway技术。
技术原理
In-Gate技术:
核心机制:同源重组(HR)技术。
构建含同源重组接头的线性化载体;将目的基因两端添加同源重组接头,通过一步同源重组直接连接,形成完整文库质粒

SMART技术:
核心机制:基于反转录酶的模板切换功能。
在RNA逆转录时,通过SMART引物在cDNA的5'端添加特定序列;利用LD-PCR(长距离PCR)扩增cDNA,并与线性化载体通过体内重组连接。

Gateway技术:
核心机制:依赖λ噬菌体重组酶系统(BP/LR反应)。
BP反应:将目的基因克隆到入门载体;
LR反应:通过重组酶将基因转移到目标表达载体。

技术优势
· 不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白,还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子
· 可以检测更接近生理状态下的相互作用蛋白
· 可提供多种蛋白互作方法进行进一步验证
酵母文库构建技术对比
| In-Gate技术 | SMART技术 | Gateway技术 | |
|---|---|---|---|
| 步骤 | 1步同源重组 | 逆转录+PCR+重组 | 2步重组(BP+LR) |
| 耗时 | 较短 | 中等 | 较长(初始构建慢) |
| 成本 | 较低 | 中等 | 高(试剂昂贵) |
| RNA需求量 | 高(>400 μg) | 极低(>2 μg) | 高(>400 μg) |
| 保真度 | 高(无PCR步骤) | 中(PCR可能突变) | 高(无PCR) |
| 优势 | 一步重组,高效快速,适合高通量筛选 高全长率(减少移码突变) |
适用微量RNA样本(如稀有组织) 均一化处理提升低丰度基因检出率 |
克隆效率高(>95%),阅读框精准保留 可多载体穿梭(同一基因导入不同表达系统) |
| 劣势 | 新技术,应用案例较少 实验条件依赖性强(如同源接头设计) |
PCR扩增可能引入碱基突变或移码 操作复杂(需优化逆转录条件) |
两次重组导致低丰度基因丢失 成本高(重组酶试剂昂贵) |
服务优势
1、具备多种材料RNA提取方法,高质量RNA有效提高后续文库质量
2、完善的质检流程,文库进行PCR鉴定,确保文库质量
3、提供后续文库售后和下游筛库指导
4、建库一年送三险,运输损坏险、储存不当险、意外丢失险,解决后顾之忧
5、根据不同的载体需求,提供文库个性化定制
交付内容及周期
| 服务内容 | 交付周期(工作日) | 交付材料 | |
|---|---|---|---|
| (In-Gate)酵母核/膜文库构建 | RNA提取 mRNA提取 |
5个 | 1.酵母核文库甘油菌8 ml(分8管);酵母膜文库甘油菌4 ml(分4管) 2. 酵母核文库质粒600 μg(分6管);酵母膜文库质粒(4管 >400 ug) 3. Word文档电子版项目报告(含实验数据) 4. 文库承诺达到以下指标:文库库容量>1*107 CFU核文库平均插入片段1-1.5 kb (因物种而异);膜文库平均插入片段0.8 - 1.5 kb(因物种而异)空载率<5% |
| cDNA合成 cDNA与接头连接 cDNA分级分离 |
5个 | ||
| 重组到酵母载体pGADT7(核)/pPR3-N(膜)上和电转化 将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增 |
5个 | ||
| 文库检测和质粒提取 | 5个 | ||
| 数据整理和分析 | 2个 | ||
| 转录组测序、文库全测序、GO+KEGG分析 | 15个 | ||
| (SMART)酵母核/膜/逆境文库构建 | RNA提取 mRNA提取 |
5个 | 酵母文库甘油菌各4 ml(分4管) 酵母文库质粒(4管>400ug) Word文档电子版项目报告(含实验数据) 文库承诺达到以下指标: 文库库容量>1*107 CFU 平均插入片段0.8 -1.5 kb(因物种而异) 空载率<5% |
| cDNA合成与接头连接(三框文库) cDNA均一化 重组到酵母载体pGADT7(核)/pPR3-N(膜)/pYES2 - NTB(逆境)上和电转化 将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增 文库检测和质粒提取 数据整理和分析 |
17个 | ||
| 转录组测序、文库全测序、GO+KEGG分析 | 15个 | ||
| (Gateway)酵母核/膜文库构建 | RNA提取 mRNA提取 |
5个 | 初级文库、次级文库甘油菌各4 ml(分4管) 初级文库(2管>200ug)、次级-核文库质粒(4管>400ug)、次级-膜文库质粒(4管>400ug) Word文档电子版项目报告(含实验数据) 文库承诺达到以下指标: 文库库容量>1*107 CFU 平均插入片段0.8-1.5 kb(因物种而异) 空载率<5% |
| cDNA第一链合成 cDNA第二链合成 cDNA adapter的制备 cDNA与attB1重组接头连接 cDNA分级分离 BP重组(pDONR222) 电转化大肠杆菌DH10B 文库质检与质粒提取 文库质粒重组pGADT7(核)/pPR3-N(膜)电转化大肠杆菌DH10B 文库质检与质粒提取 数据整理和分析 |
17个 |
注:酵母核、膜、逆境文库构建所用载体不一样。