酵母文库构建
产品描述
服务简介
酵母文库构建是一项将外源DNA片段（如cDNA、基因组DNA或人工设计的序列）高效插入酵母表达载体，并转化进酵母细胞群体，形成大规模克隆集合的核心技术。该文库可用于高通量筛选目标基因或研究基因功能。七辰生物可提供以下三种建库方法：In-Gate技术、SMART技术、Gateway技术。
技术原理
In-Gate技术：
核心机制：同源重组（HR）技术。
构建含同源重组接头的线性化载体；将目的基因两端添加同源重组接头，通过一步同源重组直接连接，形成完整文库质粒
SMART技术：
核心机制：基于反转录酶的模板切换功能。
在RNA逆转录时，通过SMART引物在cDNA的5'端添加特定序列；利用LD-PCR（长距离PCR）扩增cDNA，并与线性化载体通过体内重组连接。
Gateway技术：
核心机制：依赖λ噬菌体重组酶系统（BP/LR反应）。
BP反应：将目的基因克隆到入门载体；
LR反应：通过重组酶将基因转移到目标表达载体。
技术优势
· 不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子
· 可以检测更接近生理状态下的相互作用蛋白
· 可提供多种蛋白互作方法进行进一步验证
酵母文库构建技术对比
| In-Gate技术 | SMART技术 | Gateway技术 | |
|---|---|---|---|
| 步骤 | 1步同源重组 | 逆转录+PCR+重组 | 2步重组（BP+LR） |
| 耗时 | 较短 | 中等 | 较长（初始构建慢） |
| 成本 | 较低 | 中等 | 高（试剂昂贵） |
| RNA需求量 | 高（>400 μg） | 极低（>2 μg） | 高（>400 μg） |
| 保真度 | 高（无PCR步骤） | 中（PCR可能突变） | 高（无PCR） |
| 优势 | 一步重组，高效快速，适合高通量筛选 高全长率（减少移码突变） |
适用微量RNA样本（如稀有组织） 均一化处理提升低丰度基因检出率 |
克隆效率高（>95%），阅读框精准保留 可多载体穿梭（同一基因导入不同表达系统） |
| 劣势 | 新技术，应用案例较少 实验条件依赖性强（如同源接头设计） |
PCR扩增可能引入碱基突变或移码 操作复杂（需优化逆转录条件） |
两次重组导致低丰度基因丢失 成本高（重组酶试剂昂贵） |
服务优势
1、具备多种材料RNA提取方法，高质量RNA有效提高后续文库质量
2、完善的质检流程，文库进行PCR鉴定，确保文库质量
3、提供后续文库售后和下游筛库指导
4、建库一年送三险，运输损坏险、储存不当险、意外丢失险，解决后顾之忧
5、根据不同的载体需求，提供文库个性化定制
交付内容及周期
| 服务内容 | 交付周期（工作日） | 交付材料 | |
|---|---|---|---|
| （In-Gate）酵母核/膜文库构建 | RNA提取 mRNA提取 |
5个 | 1.酵母核文库甘油菌8 ml（分8管）；酵母膜文库甘油菌4 ml（分4管） 2. 酵母核文库质粒600 μg（分6管）；酵母膜文库质粒（4管 ＞400 ug） 3. Word文档电子版项目报告（含实验数据） 4. 文库承诺达到以下指标：文库库容量>1*107 CFU核文库平均插入片段1-1.5 kb (因物种而异)；膜文库平均插入片段0.8 - 1.5 kb(因物种而异)空载率<5% |
| cDNA合成 cDNA与接头连接 cDNA分级分离 |
5个 | ||
| 重组到酵母载体pGADT7(核)/pPR3-N(膜）上和电转化 将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增 |
5个 | ||
| 文库检测和质粒提取 | 5个 | ||
| 数据整理和分析 | 2个 | ||
| 转录组测序、文库全测序、GO+KEGG分析 | 15个 | ||
| （SMART）酵母核/膜/逆境文库构建 | RNA提取 mRNA提取 |
5个 | 酵母文库甘油菌各4 ml(分4管） 酵母文库质粒（4管＞400ug） Word文档电子版项目报告(含实验数据) 文库承诺达到以下指标: 文库库容量>1*107 CFU 平均插入片段0.8 -1.5 kb（因物种而异） 空载率<5% |
| cDNA合成与接头连接（三框文库） cDNA均一化 重组到酵母载体pGADT7(核)/pPR3-N(膜）/pYES2 - NTB(逆境)上和电转化 将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增 文库检测和质粒提取 数据整理和分析 |
17个 | ||
| 转录组测序、文库全测序、GO+KEGG分析 | 15个 | ||
| （Gateway）酵母核/膜文库构建 | RNA提取 mRNA提取 |
5个 | 初级文库、次级文库甘油菌各4 ml(分4管） 初级文库（2管＞200ug）、次级-核文库质粒（4管＞400ug）、次级-膜文库质粒（4管＞400ug） Word文档电子版项目报告(含实验数据) 文库承诺达到以下指标: 文库库容量>1*107 CFU 平均插入片段0.8-1.5 kb（因物种而异） 空载率<5% |
| cDNA第一链合成 cDNA第二链合成 cDNA adapter的制备 cDNA与attB1重组接头连接 cDNA分级分离 BP重组(pDONR222) 电转化大肠杆菌DH10B 文库质检与质粒提取 文库质粒重组pGADT7(核)/pPR3-N(膜）电转化大肠杆菌DH10B 文库质检与质粒提取 数据整理和分析 |
17个 |
注：酵母核、膜、逆境文库构建所用载体不一样。